Применение метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения уровня гликированного гемоглобина у больных сахарным диабетом

Сафронова О.Н., Сергеева С.М., Романовская И.О.

Сахарный диабет (СД) - системное заболевание обмена веществ, которое приняло пандемический характер распространения. За последние 30 лет по темпам прироста заболеваемости СД опередил многие инфекционные заболевания, а численность больных СД в мире выросла более, чем в 2 раза и достигла в 2011г 366 млн. человек. В РФ, как и во всех странах мира, отмечаются высокие темпы роста заболеваемости СД, по данным Государственного регистра насчитывается 3,357 млн. больных СД. Самыми опасными последствиями глобальной эпидемии СД являются его системные сосудистые осложнения: ретинопатия, нефропатия, поражение магистральных сосудов сердца, головного мозга, периферических сосудов нижних конечностей. Именно эти осложнения – основная причина инвалидизации и смертности больных СД. Лечение СД направлено на предотвращение, отсрочку, замедление или прекращение развития поздних осложнений.

Диагностика СД, контроль эффективности проводимой терапии не возможны без использования лабораторных методов исследования, среди которых важнейшим в настоящее время признается исследование гликированного гемоглобина.

Гликированный (гликозилированный) гемоглобин (HbAlc) - это соединение гемоглобина с глюкозой, которое образуется в результате неферментативной химической реакции гемоглобина А, содержащегося в эритроцитах, с глюкозой крови. Скорость и объем этой реакции зависят от среднего уровня глюкозы крови на протяжении жизни эритроцита. Таким образом, уровень гликированного гемоглобина отражает гликемию, имевшую место на протяжении периода жизни эритроцита (до 120 суток), т.е. по содержанию гликированного гемоглобина можно судить о том, какой была концентрация глюкозы за предшествующие исследованию 4-8 недель. В связи с этим больным сахарным диабетом рекомендуется проводить исследование уровня гликированного гемоглобина раз в квартал для контроля терапии диабета, и через 4-6 недель после изменения тактики лечения [1]. Существует несколько форм гликированного гемоглобина: HbAla, HbAlb, HbAlc. Последняя форма количественно преобладает и дает более тесную корреляцию со степенью выраженности гипергликемии, поэтому в ходе проспективных исследований DCCT (Diabetes Control and Complications Trial, 1983-1993 гг.) было определено, что из всех вариантов гликированного гемоглобина клинически значимо лишь определение фракции HbAlc [2].

Методы определения гликированного гемоглобина включают в себя электрофорез, иммунные тесты и хроматографию [3]. Учитывая узкий диапазон значений гликированного гемоглобина, по которым оценивается степень компенсации СД, а следовательно, и эффективность проводимой терапии, метод определения гликированного гемоглобина должен удовлетворять следующим требованиям: метод должен быть сертифицирован (сертификат NGSP или IFCC), в процессе анализа должна быть обеспечена возможность прямого определение фракции гликированного гемоглобина HbAlc, внутри- и межлабораторный коэффициент вариации не должен превышать 4 %, исследование должно быть непродолжительным.

Наиболее полно современным требованиям соответствует метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), который используется ведущими лабораториями мира. Метод ВЭЖХ успешно реализован компанией «Био-Рад Лаборатории » в анализаторе D- 10. Компания является мировым лидером в производстве оборудования и наборов реагентов для определения гликированного гемоглобина. Использование анализатора D10 «Био-Рад» позволяет обеспечить необходимую воспроизводимость результатов определения HbА1с: коэффициент вариации составляет 1,5-2,0%. Анализатор имеет сертификат NGSP, эта программа предлагает стандарты, руководствуясь рекомендациям DCCT (Diabetes Control and Complication Trial). Анализатор D-10 снабжен встроенной системой контроля качества. Применение контроля позволяет обеспечить высокий уровень автоматизации. Для проведения анализа может быть использована как венозная, так и капиллярная крови. Время одного анализа составляет 3 минуты.

В нашей лаборатории накоплен значительный опыт по исследованию уровня гликированного гемоглобина с использованием анализатора D-10 компании Био-Рад. Анализатор позволяет определять процент HbА1с в цельной крови человека с помощью ионообменной высокоэффективной жидкостной хроматографии. При этом происходит автоматическое разведение пробы, инъекция пробы в аналитический картридж, где создается запрограммированный буферный градиент возрастающей концентрации ионов, благодаря которому осуществляется разделение гемоглобинов на основе их ионных взаимодействий с материалом картриджа. Затем разделенные гемоглобины проходят через проточную ячейку фотометра, где происходят измерения изменений поглощения при длине волны 415 нм. Результат исследования выдается в виде хроматограммы, на которой четко видны различные варианты гемоглобина, каждый из которых имеет свой собственный пик (рис.1). Рассчитывается площадь и процентное содержание гемоглобина А1с. Результаты не требуют дальнейших пересчетов, в то время как результаты определения HbA1c, полученных на анализаторах, ориентированных на стандарты IFCC, должны быть пересчитаны по специальной формуле. В работе используются калибраторы и контрольные материалы фирмы Био-Рад. Внутрилабораторный контроль качества проводится в каждой аналитической серии по двум уровням аттестованных контрольных образцов. Участие в системе внешнего контроля качества РФ ФСВОК позволяет получить оценку по следующим параметрам: повторяемости (внутрисерийной вариации), воспроизводимости.

Рис. 1. (междневной) и правильности.

Проведение исследования уровня НbА1с в представляемых ФСВОК образцах (по 2 в каждом цикле из двух ежегодных) показало, что полученные нами данные во всех случаях входили в диапазон допустимых для метода ВЭЖХ. Практическое использование методики в клинико-диагностической лаборатории ЦП ОАО «РЖД» начато в 2009 году. Определение уровня гликированного гемоглобина проводилось у пациентов, направленных на анализ эндокринологами поликлиники. Объем исследований неуклонно возрастал. (табл.1).

Таблица 1

При этом более чем у половины пациентов (59% случаев) уровень HbA1с был выше 6%.

Интерпретация результатов определения уровня HbA1с у пациентов проводилась с учетом современных представлений о клинической значимости метода. В 2011 году ВОЗ одобрила возможности использования гликозилированного гемоглобина для диагностики СД. В качестве диагностического критерия выбран уровень HbA1c > 6,5%, нормальным считается уровень HbA1c до 6,0%. Вместе с тем, базируясь на международном и отечественном опыте лечения СД, включая рекомендации IDF 2005; AACE 2009; ISPAD 2009; РАЭ2011, внесены изменения в тактику ведения пациентов при сахарном диабете 1 и 2 типа. Согласно этим изменениям, выбор индивидуальных терапевтических целей основывается на значениях уровеня HbA1c, который расценивается в зависимости от возраста пациента, ожидаемой продолжительности жизни, риска тяжелой гипогликемии и наличия поздних микро- и макрососудистых осложнений. (табл. 1).

Таблица 1

Таким образом, результаты теста помогают врачу выработать тактику ведения пациента, т.к. определение HbA1c позволяет судить об уровне глюко- зы в крови за последние 6-8 недель.

Поддержание уровня гликированного гемоглобина в крови на близких к норме значениях помогает снизить частоту сосудистых осложнений СД или замедлить их прогрессирование, т.е. сохранить на более длительное время трудоспособность больных.

Список литературы:

1. Diabetes, «Hemoglobin A1c as an Indikator of the Degree of Glucose Intolerance in Diabetes», 25(3):230-2, 1976.
2. Алгоритмы специализированной медицинской помощи больным сахарным диабетом (издание второе). М.,2006.
3. Ильин А.В. Уровень гликированного гемоглобина – ключевой параметр контроля в лечении сахарного диабета и профилактике его осложнений. Лаборатория. 1,2008.